双荧光素酶现实的旨趣是期骗荧光素酶与底物和洽发生化学发光反馈的特色，把感兴致的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因（firefly luciferase）的上游，构建成荧光素酶陈说质粒。然后转染细胞，合乎刺激或料理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的上下判断刺激前后或不同刺激对感兴致的调控元件的影响。同期，为了减少内在的变化身分对现实准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（rinilla luciferase)的质粒行动对照质粒与陈说基因质粒共转染细胞，提供转录活力的内对照赌钱app下载，使测试恶果不受现实条目变化的干涉。

发光旨趣

双萤光素酶现实的具体要领

1、陈说基因质粒的构建。将见地片断插入到荧光素酶抒发的陈说基因载体上，如pGL3-basic。

2、转染细胞。将陈说基因质粒和phRL-TK(内参)共转染细胞，字据需要对细胞进行料理。共转染时，由于内参具有很强的开动子，因此陈说基因质粒：内参转染量一般为10:1~50:1。

Luciferase活性测定：⑴ 初度使用时，配制LAR II，即Firefly luciferase的底物。将LAR II熔解在LAR II buffer中，并分装-80℃避光保存。⑵ 加入1X PLB，室温裂解细胞15 min。⑶配制Stop&Glo，即Renilla luciferase的底物，有时断绝LAR II的反馈。⑷ 测定荧光值。向40 ul的LAR II中加入10 ul细胞裂解液，奏乐混匀后，检测读数，即为Firefly luciferase的值。加入40 ul Stop&Glo，再次读数，即为Renilla luciferase的值。⑸ 数据料理。最初贪图出每管的Firefly luciferase/Renillaluciferase的比值，再以control组的比值为单元1，即可赢得不同料理组的相对luciferase活性，也即是该料理组基因转录的调控活性。

恶果解读

文件一：PMID: 28697764；IF=41.444

（1）行为

（2）恶果

考据linc00673和miR-150-5p的和洽情况。野生型linc00673可与miR-150-5p和洽，但突变型linc00673却不可。通过构建荧光素酶陈说载体，将荧光素酶与linc00673基因诱骗，然后转染到细胞内检测荧光活性。恶果标明，miR-150-5p mimics权贵镌汰了野生型linc00673的荧光素酶活性，但对突变型linc00673荧光素酶活性莫得影响。以上恶果标明，linc00673可与miR-150-5p和洽。

文件二：PMID: 35963157；IF=5.741

（1）行为

（2）恶果：

考据YAF2和miR-217-5p的和洽情况。野生型YAF2可与miR-217-5p和洽，但突变型YAF2却不可。通过构建荧光素酶陈说载体，将荧光素酶与YAF2基因诱骗，然后转染到细胞内进行检测。恶果标明，miR-217-5p mimics权贵镌汰了野生型YAF2的荧光素酶活性，但对突变型YAF2荧光素酶活性莫得影响。以上恶果标明，YAF2可与miR-217-5p和洽。

文件三：PMID: 35212607；IF=6.832

（1）行为

（2）恶果

本商议考据了PEG10和miR-449a以及RPS2与miR-449a的和洽情况。这里以PEG10和miR-449a为例。野生型PEG10可与miR-449a和洽，但突变型PEG10却不可。通过构建荧光素酶陈说载体，将荧光素酶与PEG10基因诱骗，然后转染到细胞内进行检测。恶果标明，miR-449a mimics权贵镌汰了野生型PEG10的荧光素酶活性，但对突变型PEG10荧光素酶活性莫得影响。解说PEG10与miR-449a靶向和洽。

文件四：PMID: 35110549；IF=9.685

（1）行为

（2）恶果

考据PAARH和HOTTIP区别与六种miRNA的和洽。以上恶果涌现，miRNA转染组的荧光活性权贵镌汰，标明miRNA与PAARH和HOTTIP之间存在靶向和洽。

把稳该商议中莫得突变型的恶果，这么的例子很少，一般荧光素酶的恶果是需要包括突变型和野生型的，我方联想现实的工夫把稳一下。

所用耗材：

NEST酶标板

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